時間分辨熒光

免疫熒光是一種將抗原抗體結(jié)合反應(yīng)與生物標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)，在科研及臨床上有著廣泛的應(yīng)用。普通的免疫熒光技術(shù)在對抗原含量進行測定時存在一定的局限性，在生物流體和血清中的許多復(fù)合物和蛋白本身就可以發(fā)熒光，用普通熒光素來檢測生物樣品時，蛋白質(zhì)本身產(chǎn)生的熒光會對實驗產(chǎn)生干擾，實驗檢測的靈敏度嚴重下降。為了解決這一問題，1983年SOINI和KOJOLA提出以鑭系元素標(biāo)記為示蹤螯合物和熒光測量相結(jié)合，建立了時間分辨熒光分析技術(shù)。時間分辨方式的免疫熒光分析方法可以對蛋白質(zhì)、酶以及同位素等物質(zhì)進行標(biāo)記，并且不再受檢測物種自然熒光的干擾。

技術(shù)原理

鑭系元素共有15中，常用的有4中：釤（SM），銪（Eu），鏑（Dy）,锝（Te）。鑭系元素的半衰期很長（介于10-1000us之間，背景物質(zhì)的半衰期為1-10ns），利用鑭系元素的熒光特點，通過延長檢測時間，在待測樣品中短壽命的自然熒光完全衰變后再進行檢測，即可將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來。

熒光信號衰變時間對比

圖1：熒光信號衰變時間對比

在POCT領(lǐng)域，免疫熒光平臺最常用的就是時間分辨免疫熒光，其實驗原理如下：當(dāng)將含有待測抗原（抗體）的樣品滴在加樣區(qū)，待測樣品中的抗原（抗體）與結(jié)合墊中的熒光納米微球標(biāo)記的抗體（抗原）結(jié)合并通過毛細作用向前層析，當(dāng)達到檢測區(qū)后，與檢測線上固定的抗體（抗原）結(jié)合，形成微粒-抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合物并被固定在檢測線上，而多余的熒光微球標(biāo)記物繼續(xù)向前層析，與固定在質(zhì)控線二抗結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，用紫外光源（365nm）對檢測區(qū)掃描檢測，檢測線和質(zhì)控線上熒光納米微球發(fā)出高強度的熒光（615nm），且衰變時間也較長。延緩測量時間，待樣品基質(zhì)中自然發(fā)生的短壽命熒光（1-10ns）全部衰變后，再測量稀土元素的特異性熒光。通過檢測線和質(zhì)控線熒光強度的強弱及其比值，即可分析出樣品中待測物的濃度。

時間分辨熒光技術(shù)原理

圖2：時間分辨熒光實驗原理

鑭系元素特點

時間分辨熒光免疫分析法之所以能夠繼酶免、放免、化學(xué)發(fā)光后成為一種更新、更靈敏的檢測方法，主要取決于它用鑭系元素物理及化學(xué)性質(zhì)。

壽命長

鑭系元素擁有極長的熒光衰退時間（例如銪元素衰退時間為730000ns，釤元素衰退時間為50000ns），通過延長檢測時間即可消除實驗的本底干擾。

Stockes位移大

StoKes位移是指激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的光譜波峰的波長差。波長差越大，越容易將兩個波長區(qū)分開來，排除干擾。例如銪的激發(fā)光波長340nm，發(fā)射光波長613nm，兩者之間的波長差為273nm，所以激發(fā)光和發(fā)射光很容易用干涉濾光片分靠。而普通熒光物質(zhì)的激發(fā)光與發(fā)射光之間的波長差為28nm，那就很難排除激發(fā)光對發(fā)射光的干擾，影響檢測結(jié)果。

特異性強

鑭系元素的發(fā)射光譜很窄（615±5nm），狹窄的發(fā)射峰，通過波長分辨，很容易將特異性與非特異性熒光分辨開來。